農(nóng)藥殘留量測(cè)定法

    本方法系用氣相色譜法（通則0521）和質(zhì)譜法（通則 0431）測(cè)定藥材、飲片及制劑中部分農(nóng)藥殘留量。除另有規(guī)定外，按下列方法測(cè)定。

    對(duì)照品貯備溶液的制備  精密稱取六六六（BHC）（α-BHC，β-BHC，γ-BHC，δ-BHC）、滴滴涕（DDT） （p，p'-DDE，p，p'-DDD，o，p'-DDT，p，p'-DDT）及五氯硝基苯 （PCNB）農(nóng)藥對(duì)照品適量，用石油醚（60～90℃）分別制成每1ml約含4～5μg的溶液，即得。

    混合對(duì)照品貯備溶液的制備  精密量取上述各對(duì)照品貯備液0.5ml，置10ml量瓶中，用石油醚（60～90℃）稀釋刻度，搖勻，即得。

    混合對(duì)照品溶液的制備  精密量取上述混合對(duì)照品貯備液，用石油醚（60～90℃）制成每1L分別含0μg、1μg、5μg、 10μg、50μg、100μg、250μg的溶液，即得。

    供試品溶液的制備  藥材或飲片  取供試品，粉碎成粉末（過(guò)三號(hào)篩），取約2g，精密稱定，置100ml具塞錐形瓶中，加水20ml浸泡過(guò)夜，精密加丙酮40ml，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用丙酮補(bǔ)足減失的重量，，稱定重量，超聲15分鐘，再稱定重量，用二氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，靜置（使分層），將有機(jī)相迅速移入裝有適量無(wú)水*的100ml具塞錐形瓶中，放置4小時(shí)。精密量取35ml，于40℃水浴上減壓濃縮近干，加少量石油醚（60～90℃），用石油醚（60～90℃）溶解 并轉(zhuǎn)移10ml具塞刻度離心管中，加石油醚（60～90℃）精密稀釋5ml，小心加入硫酸1ml，振搖1分鐘，離心（3000 轉(zhuǎn)/分鐘）10分鐘，精密量取上清液2ml，置具刻度的濃縮瓶 （見圖）中，連接旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，40℃下（或用氮?dú)猓⑷芤簼饪s適量，精密稀釋1ml，即得。

    制劑  取供試品，研成細(xì)粉（蜜丸切碎，液體直接量?。芊Q取適量（相當(dāng)于藥材2g），以下按上述供試品溶液制備法制備，即得供試品溶液。

    測(cè)定法  分別精密吸取供試品溶液和與之相對(duì)應(yīng)濃度的混合對(duì)照品溶液各1μl，注入氣相色譜儀，按外標(biāo)法計(jì)算供試品中9種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量。

    2.22種有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留量測(cè)定法

    色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)  分析柱：以50%苯基50%二甲基聚硅氧烷為固定液的彈性石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm），驗(yàn)證柱：以100%硅氧烷為固定液的彈性石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm），63Ni-ECD電子捕獲檢測(cè)器。進(jìn)樣口溫度240℃，檢測(cè)器溫度300℃，不分流進(jìn)樣，流速為恒壓模式（初始流速為1.3ml/min）。程序升溫：初始70℃，保持1分鐘，每分鐘10℃升180℃，保持5分鐘，再以每分鐘5℃升220℃，后以每分鐘100℃升280℃，保持8分鐘。理論板數(shù)按α-BHC計(jì)算應(yīng)不低于1×106，兩個(gè)相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5。

    對(duì)照品貯備溶液的制備  精密稱取表1中農(nóng)藥對(duì)照品適量，用異辛烷分別制成如表1中濃度，即得。

    混合對(duì)照品貯備溶液的制備  精密量取上述對(duì)照品貯備溶液各1ml，置100ml量瓶中，用異辛烷稀釋刻度，搖勻，即得。

    混合對(duì)照品溶液的制備  分別精密量取上述混合對(duì)照品貯備溶液，用異辛烷制成每1L分別含10μg、20μg、50μg、100μg、200μg、500μg的溶液，即得（其中β-六六六、異、p，p'-滴滴滴、o，p'-滴滴涕每1L分別含20μg、40μg、100μg、200μg、400μg、1000μg）。

    供試品溶液的制備  取供試品，粉碎成粉末（過(guò)三號(hào)篩），取約1.5g，精密稱定，置于50ml聚苯乙烯具塞離心管中，加入水10ml，混勻，放置2小時(shí)，精密加入乙腈15ml，劇烈振搖提取1分鐘，再加入預(yù)先稱好的無(wú)水硫酸鎂4g與氯化鈉1g的混合粉末，再次劇烈振搖1分鐘后，離心（4000轉(zhuǎn)/分鐘）1分鐘。精密吸取上清液10ml，40℃減壓濃縮近干，用環(huán)己烷-乙酸乙酯（1：1）混合溶液分次轉(zhuǎn)移10ml量瓶中，加環(huán)己烷-乙酸乙酯（1：1）混合溶液刻度，搖勻，轉(zhuǎn)移預(yù)先加入1g無(wú)水*的離心管中，振搖，放置1小時(shí)，離心（必要時(shí)濾過(guò)），取上清液5ml過(guò)凝膠滲透色譜柱（400mm×25mm，內(nèi)裝BIO-Beads S-X3填料；以環(huán)己烷-乙酸（1：1）混合溶液為流動(dòng)相；流速為每分鐘5.0ml）凈化，收集18～30分鐘的洗脫液，于40℃水浴減壓濃縮近干，加少量正己烷替換兩次，加正己烷1ml使溶解，轉(zhuǎn)移弗羅里硅土固相萃取小柱[1000mg/6ml，用正己烷-丙酮（95：5）混合溶液10ml和正己烷10ml預(yù)洗]上，殘?jiān)谜和橄礈?次，每次1ml，洗液轉(zhuǎn)移同一弗羅里硅土固相萃取小柱上，再用正己烷-丙酮（95：5）混合溶液10ml洗脫，收集全部洗脫液，置氮吹儀上吹近干，加異辛烷定容1ml，渦旋使溶解，即得。

    測(cè)定法  分別精密吸取供試品溶液和混合對(duì)照品溶液各1μl，注入氣相色譜儀，按外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算供試品中22種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量。

    限度  除另有規(guī)定外，每1kg中藥材或飲片中含總六六六（α-BHC，β-BHC，γ-BHC，δ-BHC之和）不得過(guò)0.2mg；總滴滴涕（p，p'-DDE，p，p'-DDD，o，p'-DDT，p，p'-DDT之和）不得過(guò)0.2mg；五氯硝基苯（Quintozene）不得過(guò)0.1mg；（Hexachlorobenzene）不得過(guò) 0.1mg；七氯（Heptachlor）、順式環(huán)氧七氯（Heptachlor-exo-epoxide）和反式環(huán)氧七氯（Heptachlor-endo-epoxide）之和不得過(guò)0.05mg；（Aldrin）和（Dieldrin）之和不得過(guò)0.05mg；異（Endrin）不得過(guò)0.05mg；順式氯丹（cis-Chlordane）、反式氯丹（trans-Chlordane）和氧化氯丹（oxy-Chlordane）之和不得過(guò)0.05mg； α-硫丹（α-Endosulfan）、β-硫丹（β-Endosulfan）和硫丹硫酸鹽（Endosulfan sulfate）之和不得過(guò)3mg。

    【附注】

    （1）當(dāng)供試品中有農(nóng)藥檢出時(shí)，可在驗(yàn)證柱中確認(rèn)檢出的結(jié)果，再進(jìn)行定量。必要時(shí)，可用氣相色譜--質(zhì)譜法進(jìn)行確證。

    （2）加樣回收率應(yīng)在70%～120%之間。

    第二法  有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留量測(cè)定法-色譜法

    色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)  以50%苯基50%二甲基聚硅氧烷或（5%苯基）甲基聚硅氧烷為固定液的彈性石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm），氮磷檢測(cè)器（NPD）或火焰光度檢測(cè)器（FPD）。進(jìn)樣口溫度220℃，檢測(cè)器溫度300℃，不分流進(jìn)樣。程序升溫：初始120℃，每分鐘10℃升200℃，每分鐘5℃升240℃，保持2分鐘，每分鐘20℃升270℃，保持0.5分鐘。理論板數(shù)按敵敢畏峰計(jì)算應(yīng)不低于6000，兩個(gè)相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5。

    混合對(duì)照品貯備溶液的制備  分別精密量取上述各對(duì)照品貯備溶液1ml，置20ml棕色量瓶中，加乙酸稀釋刻度，搖勻，即得。

    混合對(duì)照品溶液的制備  精密量取上述混合對(duì)照品貯備溶液，用乙酸制成每1ml含0.1μg、0.5μg、1μg、2μg、 5μg的濃度系列，即得。

    供試品溶液的制備  藥材或飲片  取供試品，粉碎成粉末（過(guò)三號(hào)篩），取約5g，精密稱定，加無(wú)水*5g，加入乙酸50～100ml，冰浴超聲處理3分鐘，放置，取上層液濾過(guò)，藥渣加入乙酸30～50ml，冰浴超聲處理2分鐘，放置，濾過(guò)，合并兩次濾液，用少量乙酸洗滌濾紙及殘?jiān)c上述濾液合并。取濾液于40℃以下減壓濃縮近干，用乙酸轉(zhuǎn)移5ml量瓶中，并稀釋刻度；精密吸取上述溶液1ml，置石墨化炭小柱（250mg/3ml用乙酸乙酯5ml預(yù)洗）上，用正己烷-乙酸（1：1）混合溶液5ml洗脫，收集洗脫液，置氮吹儀上濃縮近干，加乙酸定容1ml，渦旋使溶解，即得。

    測(cè)定法  分別精密吸取供試品溶液和與之相對(duì)應(yīng)濃度的混合對(duì)照品溶液各1μl，注入氣相色譜儀，按外標(biāo)法計(jì)算供試品中12種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量。

    第三法  農(nóng)藥殘留量測(cè)定法-色譜法

    色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)  為固定液的彈性石英毛細(xì)管柱（30m×0.32mm×0.25μm），63Ni-ECD電子捕獲檢測(cè)器。進(jìn)樣口溫度270℃， 檢測(cè)器溫度330℃。不分流進(jìn)樣（或根據(jù)儀器設(shè)置的分流比）。程序升溫：初始160℃，保持1分鐘，每分鐘10℃升278℃，保持0.5分鐘，每分鐘1℃升290℃，保持5分鐘。理論板數(shù)按峰計(jì)算應(yīng)不低于105，兩個(gè)相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5。

    對(duì)照品貯備溶液的制備  精密稱取、及農(nóng)藥對(duì)照品適量，用石油醚（60～90℃）分別制成每1ml約含20～25μg的溶液，即得。

    混合對(duì)照品貯備溶液的制備  精密量取上述各對(duì)照品貯備液1ml，置10ml量瓶中，用石油醚（60～90℃）稀釋刻度，搖勻，即得。

    混合對(duì)照品溶液的制備  精密量取上述混合對(duì)照品貯備液，用石油醚（60～90℃）制成每1L分別含0μg、2μg、8μg、40μg、200μg的溶液，即得。

    供試品溶液的制備  藥材或飲片  取供試品，粉碎成粉末（過(guò)三號(hào)篩），取約1～2g，精密稱定，置100ml具塞錐形瓶中，加石油醚（60～90℃）-丙酮（4：1）混合溶液30ml，超聲處理15分鐘，濾過(guò)，藥渣再重復(fù)上述操作2次后，合并濾液，濾液用適量無(wú)水*脫水后，于40～45℃減壓濃縮近干，用少量石油醚（60～90℃）反復(fù)操作丙酮除凈，殘?jiān)眠m量石油醚（60～90℃）溶解，置混合小柱[從上下依次為無(wú)水*2g、弗羅里硅土4g、微晶纖維素1g、氧化鋁1g、無(wú)水*2g，用石油 醚（60～90℃）-（4：1）混合溶液20ml預(yù)洗]上，用石油醚（60～90℃）-（4：1）混合溶液90ml洗脫，收集洗脫液，于40～45℃減壓濃縮近干，再用石油醚 （60～90℃）3～4ml重復(fù)操作除凈，用石油醚（60～90℃）溶解并轉(zhuǎn)移5ml量瓶中，并稀釋刻度，搖勻， 即得。

    測(cè)定法  分別精密吸取供試品溶液和與之相對(duì)應(yīng)濃度的混合對(duì)照品溶液各1μl，注入氣相色譜儀，按外標(biāo)法計(jì)算供試品中3種擬。

    第四法 農(nóng)藥多殘留量測(cè)定法-質(zhì)譜法

    1.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

    色譜條件  以5%苯基甲基聚硅氧烷為固定液的彈性石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm色譜柱）。進(jìn)樣口溫度240℃ ，不分流進(jìn)樣。載氣為高純氦氣（He）。進(jìn)樣口為恒壓模式，柱前壓力為146kPa。程序升溫：初始溫度70℃，保持2分鐘，先以每分鐘25℃升溫150℃，再以每分鐘3℃升溫200℃，后以每分鐘8℃升溫280℃，保持10分鐘。

    質(zhì)譜條件  以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)；離子源為電子轟擊源（EI），離子源溫度230℃。碰撞氣為氮?dú)饣驓鍤?。質(zhì)譜傳輸接口溫度280℃。質(zhì)譜監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），各化合物參考保留時(shí)間、監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞電壓 （CE）與檢出限參考值見表2。為提高檢測(cè)靈敏度，可根據(jù)保留時(shí)間分段監(jiān)測(cè)各農(nóng)藥。

    對(duì)照品貯備溶液的制備  精密稱取表2與表4中農(nóng)藥對(duì)照品適量，根據(jù)各農(nóng)藥溶解性加乙腈或甲苯分別制成每1ml含1000μg的溶液，即得（可根據(jù)具體農(nóng)藥的靈敏度適當(dāng)調(diào)整貯備液配制的濃度）。

    內(nèi)標(biāo)貯備溶液的制備  取氘代莠去津和氘代對(duì)照品適量，精密稱定，加乙腈溶解并制成每1ml各含1000μg的混合溶液，即得。

    混合對(duì)照品溶液的制備  精密量取上述各對(duì)照品貯備液適量，用含0.05%醋酸的乙腈分別制成每1L含100μg和 1000μg的兩種溶液，即得。

    內(nèi)標(biāo)溶液的制備  精密量取內(nèi)標(biāo)貯備溶液適量，加乙腈制成每1ml含6μg的溶液，即得。

    基質(zhì)混合對(duì)照品溶液的制備  取空白基質(zhì)樣品3g，一式6份，同供試品溶液的制備方法處理“置氮吹儀上于40℃水浴濃縮約0.4ml”，分別加入混合對(duì)照品溶液 （100μg/L）50μl、 100μl，混合對(duì)照品溶液（1000μg/L）50μl、 100μl、200μl、400μl，加乙腈定容1ml，渦旋混勻，用微孔濾膜濾過(guò)（0.22μm），取續(xù)濾液，即得系列基質(zhì)混合對(duì)照品溶液。

    供試品溶液的制備  藥材或飲片  取供試品，粉碎成粉末（過(guò)三號(hào)篩），取約3g，精密稱定，置50ml聚苯乙烯具塞離心管中，加入1%冰醋酸溶液15ml，渦旋使藥粉充分浸潤(rùn)，放置30分鐘，精密加入乙腈15ml與內(nèi)標(biāo)溶液100μl，渦旋使混勻，置振蕩器上劇烈振蕩（500次/min）5分鐘，加入無(wú)水硫酸鎂與無(wú)水乙酸鈉的混合粉末（4：1）7.5g，立即搖散，再置振蕩器上劇烈振蕩（500次/min）3分鐘，于冰浴中冷卻10分鐘，離心（4000轉(zhuǎn)/min） 5分鐘，取上清液9ml，置已預(yù)先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管[無(wú)水硫酸鎂900mg，N-丙基乙二胺（PSA）300mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠300mg，硅膠300mg，石墨化炭黑90mg]中，渦旋使充分混勻，再置振蕩器上劇烈振蕩（500次/min）5分鐘使凈化*，離心（4000轉(zhuǎn)/min） 5分鐘，精密吸取上清液5ml，置氮吹儀上于40℃水浴濃縮約0.4ml，加乙腈定容1ml，渦旋混勻，用微孔濾膜（0.22μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

    測(cè)定法  精密吸取供試品溶液和基質(zhì)混合對(duì)照品溶液各 1μl，注入氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，按內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算供試品中74種農(nóng)藥殘留量。

    2.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

    色譜條件  以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（柱長(zhǎng)15cm，內(nèi)徑為3mm，粒徑為3.5μm）；以0.1%甲酸（含10mmol/L）溶液為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B，下表3進(jìn)行梯度洗脫；柱溫為35℃，流速為0.4ml/min。

    質(zhì)譜條件  以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)；離子源為電噴霧（ESI）離子源，使用正離子掃描模式。監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），各化合物參考保留時(shí)間、監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞電壓（CE）和檢出限參考值見表4。為提高檢測(cè)靈敏度，可根據(jù)保留時(shí)間分段監(jiān)測(cè)各農(nóng)藥。

    對(duì)照品貯備溶液的制備、內(nèi)標(biāo)貯備溶液的制備、混合對(duì)照品溶液的制備、內(nèi)標(biāo)溶液的制備、基質(zhì)混合對(duì)照品溶液的制備與供試品溶液的制備  均同氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法項(xiàng)下。

    測(cè)定法  分別精密吸取氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法中的供試品溶液和基質(zhì)混合對(duì)照品工作溶液各1～10μl（根據(jù)檢測(cè)要求與儀器靈敏度可適當(dāng)調(diào)整進(jìn)樣量），注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，按內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算供試品中153種農(nóng)藥殘留量。

    【附注】（1）依據(jù)各品種項(xiàng)下規(guī)定的監(jiān)測(cè)農(nóng)藥種類并參考相關(guān)農(nóng)藥限度規(guī)定配制對(duì)照品溶液。

    （2）空白基質(zhì)樣品為經(jīng)檢測(cè)不含待測(cè)農(nóng)藥的同品種樣品。

    （3）加樣回收率應(yīng)在70%～120%之間。在方法重現(xiàn)性可獲得的情況下，部分農(nóng)藥回收率可放寬50%～130%。

    （4）進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)，如果檢出色譜峰的保留時(shí)間與對(duì)照品一致，并且在扣除背景后的質(zhì)譜圖中，所選擇的監(jiān)測(cè)離子對(duì)均出現(xiàn)，而且所選擇的監(jiān)測(cè)離子對(duì)峰面積比與對(duì)照品的監(jiān)測(cè)離子對(duì)峰面積比一致（相對(duì)比例>50%，允許±20%偏差；相對(duì)比例>20%～50%，允許±25%偏差；相對(duì)比例> 10%～20%，允許±30%偏差；相對(duì)比例≤10%，允許±50%偏差），則可判斷樣品中存在該農(nóng)藥。如果不能確證，選用其他監(jiān)測(cè)離子對(duì)重新進(jìn)樣確證或選用其他檢測(cè)方式的分析儀器進(jìn)行確證。

    （5）氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定的農(nóng)藥，推薦選擇氘代作為內(nèi)標(biāo)；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定的農(nóng)藥，推薦選擇氘代莠去津作為內(nèi)標(biāo)。

    （6）方法提供的監(jiān)測(cè)離子對(duì)測(cè)定條件為推薦條件，各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)所配置儀器的具體情況作適當(dāng)調(diào)整；在樣品基質(zhì)有測(cè)定干擾的情況下，可選用其他監(jiān)測(cè)離子對(duì)。

    （7）對(duì)于特定農(nóng)藥或供試品，分散固相萃取凈化管中凈化材料的比例可作適當(dāng)調(diào)整，但須進(jìn)行方法學(xué)考察以確保結(jié)果準(zhǔn)確。

    （8）在進(jìn)行氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定時(shí)，為進(jìn)一步優(yōu)化方法效能，供試品溶液終定容的溶劑可由乙腈經(jīng)溶劑替換為甲苯（經(jīng)氮吹近干加入甲苯1ml即可）。